凱氏定氮法測定人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量的不確定度評價

更新時間：2011-01-20 點擊次數(shù)：5068

蛋白質(zhì)含量是人血白蛋白質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù),表征合理地賦予被測量值的分散性。本文對凱氏定氮法測定人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量的不確定度來源和大小進行分析和評價,并初步探討在運用該方法的過程中應(yīng)注意的問題,旨在為人血白蛋白以及食品（尤其是乳制品）中的蛋白質(zhì)含量測定提供一定參考。推薦使用儀器：KDN-08A，蛋白質(zhì)測定儀（http://www.dsddy.cn/）。

　實驗材料及條件

1.1　儀器及試藥

儀器:自動定氮儀（ Gerhardt Vapodest 30 DigestSystem） ;玻璃儀器（ 1、2、10 mL 移液管; 20、100 mL容量瓶; 25 mL酸式滴定管） , 20 ℃下校準(zhǔn)。試藥:人血白蛋白（貴陽黔峰生物制品有限公司生產(chǎn), 批號為20070830, 規(guī)格為20% , 10 g） ;01005 mol·L - 1硫酸滴定液（本所化學(xué)室標(biāo)定） ;10%鎢酸鈉溶液; 0133 mol·L - 1硫酸溶液; 2%硼酸溶液; 40%氫氧化鈉溶液;甲基紅-溴甲酚綠混合指示液; 98%硫酸;無水硫酸鈉;硫酸銅。

1.2　實驗室環(huán)境

溫度變化范圍: （20 ±4） ℃。

　方法

2.1　試驗過程

按照中國藥典2005年版三部的規(guī)定,測定人血白蛋白中的蛋白質(zhì)含量,過程見圖1。

2.2　建立數(shù)學(xué)模型

人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量W 的計算公式為:

rep為總重復(fù)性因子。

以y表示W(wǎng) , xi表示第i個影響參數(shù),得y的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

其中ci為靈敏系數(shù),記為偏導(dǎo)5y /5x; u （ y, xi ）為由xi不確定度引起的y的不確定度。

　不確定度的來源及分析

3.1　不確定度的來源

從人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量測定流程圖來看,凱氏定氮法測定蛋白含量的不確定度主要來源于9個方面: 1）試驗重復(fù)性; 2）標(biāo)定硫酸滴定液濃度; 3）稀釋硫酸滴定液; 4）測定總氮稀釋樣品; 5）滴定總氮吸取樣品; 6）滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的體積; 7）測定非蛋白氮稀釋樣品; 8）滴定非蛋白氮吸取樣品; 9）滴定非蛋白氮實際消耗硫酸滴定液的體積。

3.2　不確定度u （ xi ）的量化分析

3.2.1　由試驗重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u （ rep）按藥典標(biāo)準(zhǔn)對人血白蛋白樣品平行測定6次,結(jié)果見表1。

　測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度: u （ rep） = s /6015 = 01002 4

3.2.2　標(biāo)定硫酸滴定液濃度引入的不確定度u （CD ）由標(biāo)定01005 mol·L - 1硫酸滴定液所引入的不確定度u （CD ） = 111 ×10- 4 mol·L - 1。

3.2.3　稀釋硫酸滴定液引入的不確定度u （VD1 / VD2 ）

試驗中需將01052 32 mol·L - 1硫酸滴定液定量稀釋成01005 232 mol·L - 1 ,根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》查得,*1010 mL移液管和*100 mL容量瓶的允許偏差分別為±0102和±0110 mL ,近似于三角形分布,換算成校準(zhǔn)不確定度分別為: 0102 /6015 = 01008 2 mL, 0110 /6015 = 01041 mL。該容量瓶和移液管均在20 ℃校準(zhǔn)。本實驗室溫度變化范圍為（20 ±4） ℃,近似于矩形分布。水的膨脹系數(shù)為211 ×10- 4。換算成溫度不確定度分別為:

3.2.4　測定總氮稀釋樣品（VT1 / VT2 ）引入的不確定度u （VT1 / VT2 ）

由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知,*110 mL移液管和A 級20 mL 容量瓶的允許偏差分別為±0.007和±0.02 mL,近似于三角形分布,換算成校準(zhǔn)不確定度分別為:

3.2.5　滴定總氮吸取樣品（VT3 ）引入的不確定度u （VT3 ）與“31214”項相同,*110 mL移液管的的校準(zhǔn)不確定度為01002 9 mL,溫度不確定度為01000 48 mL。

由上述不確定度分量合成得:

u （VT3 ） = （01002 92 + 01000 482 ） 015 = 01002 9 mL

3.2.6 　滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的體積（VT4 - V0 ）引入的不確定度u （VT4 - V0 ）1）肉眼判斷終點所引入的不確定度已包含在測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u （ rep ）中,此處不再考慮; 2）滴定管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知, 2510 mL的*滴定管其zui大容量的允許偏差為±0104 mL ,近似于三角形分布,換算成校準(zhǔn)不確度為:

3.2.7　測定非蛋白氮稀釋樣品（VN1 / VN2 ）引入的不確定度u （VN1 / VN2 ）由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知,*210 mL移液管和A 級20 mL 容量瓶的允許偏差分別為±01010和±0102 mL.,近似于三角形分布.,換算成校準(zhǔn)不確定度分別為:

3.2.8　滴定非蛋白氮吸取樣品（VN3 ）引入的不確定度u （VN3 ）

u （VN3 ）即由510 mL 移液管引入的不確定度。由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知, *510 mL 移液管的允許偏差為±01015 mL. ,近似于三角形分布.,換算成校準(zhǔn)不確定度為:

01015 /6015 = 01006 2 mL

溫度不確定度為:

510 ×211 ×10 - 4 ×4 /3015 = 01002 4 mL

由上述不確定度分量合成得:

u （VN3 ） = （01006 22 + 01002 42 ） 015 = 01006 6 mL

3.2.9　滴定非蛋白氮實際消耗硫酸滴定液的體積（VN4 - V0 ）引入的不確定度u （VN4 - V0 ）

1）肉眼判斷終點所引入的不確定度已被包含在測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u （ rep ）中,在此處不再考慮。2）滴定管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:查標(biāo)準(zhǔn)得2510 mL的*滴定管其zui大容量的允許偏差為±0104 mL ,近似于三角形分布,換算成校準(zhǔn)不確度為:

3.3　不確定分量及各分量分析

在不確定度表達式中,假如y （ x1 , x2 , ?, xi ）對xi是線性或與xi相比其u （ xi ）較小,偏導(dǎo)（ 5y /5x）可近似為:5y /5x≈ { y [ xi + u （ xi ） ] - y （ xi ） } /u （ xi ）將u （ xi ）計入,獲得因xi不確定度引起的y的不確定度u （ y, xi ） ,即:

u （ y, xi ）≈ y{ x1 , x2 ?[ xi + u （xi ） ]?xn } - y （x1 , x2 , ?, xi , ?, xn ）

根據(jù)上式,由各不確定分量u （xi ）進行計算可得到對應(yīng)的u （y, xi ） ,結(jié)果見表2。

314　合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴展不確定度的計算根據(jù)表2結(jié)果,可得合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（ uc ）為:

擴展不確定度（U）的計算公式為: U = k·uc置信因子（ k）取2,即置信概率為95% ,可得:

U = 0.62% ×2 = 1.2%故人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量W （% ）可表示為（104.7 ±1.2） %。

　討論

根據(jù)小分量不確定度不足zui大分量不確定度的1 /3時,小分量不確定度可以忽略不計的原則,由以上的評定結(jié)果可看出,本方法測定結(jié)果的不確度主要來源于6個分量:測定總氮稀釋樣品的不確定度u （VT1 / VT2 ）、滴定總氮吸取樣品的不確定度u （VT3 ）、測量重復(fù)性u （ rep ）、標(biāo)定硫酸滴定液濃度的不確定度u （CD ）、滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的不確定度u （VT4 - V0 ）、稀釋硫酸滴定液的不確定度u （VD1 / VD2 ）。

在試驗中使用的玻璃儀器均為*,因此不能通過提高儀器的精密度改善結(jié)果,但可采取下述2個措施降低本方法的不確定度。1）使用較大規(guī)格的移液管。u （VT1 / VT2 ）與u （VT3 ）較大的原因是110 mL移液管引入的不確定度明顯大于較大規(guī)格的移液管。故在使用本方法測定樣品時,在樣品量允許的前提下,通過重新設(shè)計試驗步驟,在吸取樣品時選用較大規(guī)格的移液管,將能顯著降低u （VT1 / VT2 ）與u （VT3 ）。2）使用合適的自動化儀器進行樣品消化及滴定,同時規(guī)范試驗操作,嚴(yán)格控制試驗條件,將能有效控制試驗過程中產(chǎn)生的隨機誤差,從而降低u （ rep）。

本文來自：http://www.dsddy.cn/